基因检测科普之基因拷贝数变异CNV

　　基因检测中拷贝数变异CNV(copy number variations)是非常重要的变异形式，下面来了解下什么是CNV及其常用的检测方法。

　　1、什么是CNV及其形成机制?

　　拷贝数变异属于基因组结构变异，根据大小可分为两个层次：显微水平和亚显微水平。显微水平的基因组结构变异主要是显微镜下可见的染色体畸变，包括整倍或非整倍体、缺失、插入、倒位、易位、脆性点位等结构变异。CNV在基因组中的存在形式主要有以下几种：2条同源染色体拷贝数同时出现缺失;1条同源染色体发生缺失，1条正常;一条同源染色体出现拷贝数重复，另一条正常;1条同源染色体出现缺失，另一条出现拷贝数重复;两条同源染色体同时出现拷贝数重复。

　　亚显微水平的基因组结构变异指DNA片段在1Kb-3Mb的基因组结构变异，包括缺失、插入、重复、重排、倒位、DNA拷贝数变化等，这些统称为CNV。

　　CNV最初是在病人的基因组中发现，但后来的研究表明在正常人体中也普遍存在，说明CNV是一组具有良性、致病性或未知临床意义的基因组结构改变。目前导致CNV的确切机制仍不清楚，可能的机制包括非等位基因同源性重组机制(NAHR)和非同源末端连接机制(NHEJ)。

　　2、肿瘤样本变异CNV检测意义

　　众所周知，肿瘤来源于正常体细胞基因组水平累积发生一系列的突变或畸变所造成。肿瘤样本CNV是最主要的体细胞突变形式之一。正常细胞的基因组是二倍体，而在肿瘤细胞中基因组某些区域拷贝数会发生扩增或缺失从而改变基因组原有的状态，且大小约在50bp-1Mb之间。在某些肿瘤中基因组发生缺失突变会导致(抑癌基因失活)原癌基因的激活，如RB1、P16、PTEN等;而发生扩增突变时会使(原癌基因的激活)抑癌基因失活，如MYC、HER2、EGFR等。这些基因在多种信号通路中发挥重要作用，可以促进或抑制细胞的生长、增殖、转移和复发。因此检测肿瘤特异性的CNV不仅可以更好的理解肿瘤发生的分子机制，也可以更快的发现新的肿瘤原癌基因以及抑癌基因，可为开发有效的肿瘤治疗药物提供靶点。这些肿瘤CNV研究对肿瘤患者的靶向治疗是至关重要的，医生也可以针对患者的拷贝数差异采取个性化的治疗手段，如曲妥珠单抗和帕托珠单抗对于HER2基因过度表达的转移性乳腺癌具有较好的疗效。

　　3、CNV检测的不同方法学

　　CNV检测分为细胞水平检测和DNA水平检测，细胞水平的检测包括核型分析和FISH检测，DNA水平检测包括array-CGH 、SNP-array、MLPA检测和NGS检测方法。下面介绍这几种方法。

　　核型分析：各种生物染色体的形态，结构和数目都是相对稳定的，每一生物细胞内特定的染色体组成叫染色体组型，染色体组型分析也称核型分析。从染色体玻片标本或染色体照片的对比、分析，对生物某一个体或某一分类单位(亚种、种等)的体细胞的染色体按一定特征排列起来的图像(染色体组型)，这种过程就是核型分析。核型分析的缺陷是完全依据人工判读，随意性大，无法区分亚显微结构的结构变异。

　　FISH检测：是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据，检测目标片段的拷贝数。缺陷是不同位点需单独设计探针，通量小，一般只用于固定基因的检测，无法区分LOH(杂合型缺失)。

　　array-CGH：将等量的待测DNA和正常对照DNA分别用红色和绿色荧光染料标记，混合，然后与全基因组DNA芯片进行竞争性杂交。杂交后的芯片经激光扫描，比较每个点红光和绿光的发光强度。若红光过强，表明待测样本拷贝数复制;若红光较弱，表明待测样本拷贝数缺失;若红绿光均等，则表明待测样品拷贝数正常。一般aCGH的分辨率约为6kb，无法检测小的变异，同时也无法区分LOH。

　　SNP-array：与aCGH采用的双杂交策略不同的是，SNP-array利用待测样本与芯片探针进行单杂交，通过比较不同样本信号的强度来确定每个位点的拷贝数。SNP 芯片探针在全基因组上的密度非常大，分辨率很高。但是这些探针在基因组中并非均衡分布，在一些重复序列和复杂的CNV 区域， SNP 密度是较小的，不能得到较为清晰的CNV 图谱。SNP-array的分辨率约为一般约为3kb，无法检测小的变异。

　　MLPA检测：在DNA靶序列的特定变异位点(如点突变)两侧设计一对MLPA探针。每条探针包含一段通用引物序列和一段特异性杂交序列。杂交序列与靶序列杂交后，使用连接酶将两部分探针连接成一条核苷酸单链，再使用通用引物进行PCR扩增。通过比较待测DNA与正常对照DNA的PCR产物量，来确定待测样本DNA靶序列的拷贝数。值得注意的是，连接酶很挑剔，只有在检测位点处探针与靶序列完美互补配对的情况下，连接酶才能将两部分探针顺利连接成单链进行后续扩增。如果检测位点存在甲基化、点突变、CNV，则探针连接失败，不能进行后续PCR扩增。

　　NGS检测：通过测序reads的深度，来测定目标片段的拷贝数。可同时检测多基因CNV以及其他biomarker，但算法模型受影响因素多，如panel设计、探针GC含量、肿瘤含量、污染等。

　　4、绝对CNV还是相对CNV?

　　若检测报告中报的是相对CNV(样本中包含正常细胞和肿瘤细胞)，当知道样本中肿瘤细胞占比的情况下，可通过以下公式粗略换算目标基因的肿瘤细胞 CNV(即绝对CNV)：

　　报告 CNV = 绝对 CNV × 肿瘤占比 + 2 ×(1 - 肿瘤占比)

　　假设肿瘤细胞中目标基因CN 为 20，当肿瘤占比仅为 10%时，实际检出 CN 值仅约为3.8(报告也即相对CNV)。因此，当肿瘤细胞含量比较低时，CNV 的检出敏感性显著降低。故为保证CNV的检测敏感性，检测时须要求一定含量的肿瘤细胞含量。

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